lb培养基的配方详解，高效感受态细胞制作？-营销圈

lb培养基的配方详解，高效感受态细胞制作？

用户投稿 • 2022年6月13日 am9:15 • 网络资讯 • 阅读 642

实验·原理

通过电击法或CaCl2、RbCl(KCl)等化学试剂处理，使细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。RbCl法制备的感受态细胞转化效率较高。

实验试剂· 器材

试剂

器材

lb培养基的配方详解，高效感受态细胞制作？

操作方法

一、LB培养基配制（固体培养基加2%琼脂粉）

二、TFBI溶液配制

三、TFBII溶液配制

四、高效感受态细胞制备

1. 取实验室-80℃保存的DH5α菌种在无抗性的LB平板上划线，37℃培养过夜，进行活化；

2. 从LB平板上挑取单菌落，尽量选择菌落较饱满，边缘平滑，个头较大、长势较好的菌落；

3. 挑选上述单菌落接种于装有10ml无抗性LB液体培养基的25ml锥形瓶中；

4. 37℃下振荡培养过夜（摇床转速 200rpm，12h左右），进行充分活化；

5. 将上述菌液以1:100的比例接种到大的锥形瓶中，37℃振荡培养2～2.5h（尽量不要超时），至OD590达0.4~0.6；

6. 将培养好的菌液转入洁净无菌的50ml离心管中，冰上放置10min（此时，可以将配置好的TBFI溶液冰浴预冷，离心机预冷至4℃，如果离心机降温较慢，最好再提前一点）；

7. 在4℃下，4000rpm离心10min，弃去上清；

8. 加入初始细菌培养基1/2.5的冰上预冷的TBFI溶液（如果前面使用的是60ml，这里则为60/2.5=24ml），轻轻悬浮细胞，冰上放置10min；

9. 4℃，4000rpm离心10min，弃去上清；

10. 加入初始细菌培养基1/25体积的预冷TBFII（如果前面使用的是60ml，这里则为60/25=2.4ml，也即为TBFI的1/10，当然具体体积也可以根据个人经验上下变动），轻轻悬浮菌沉；

11. 分装至EP管中，每管分装100μl（EP管最好预冷，分装过程要求在冰上进行）。

12. -80℃冰箱长期保存，定期活化，有利于长期保存。（保存中不要断电，否则细胞可能失活）。

[ 特别提示 ]

-80℃冰箱储存的感受态细胞在6-8周后，转化率很快降低，可用已知标准及浓度的闭环质粒鉴定感受态细胞的转化能力。

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